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　　次氯酸钠（NaClO）因操作简便、杀菌高效、成本低廉而被广泛使用，但不当使用可能诱导细菌进入可存活但不可培养（VBNC）状态。此类细菌虽不能形成菌落，却仍保持代谢活性，在适宜条件下可复苏，威胁食品安全与公共卫生。高通量转录组与蛋白质组技术为研究细菌应激机制提供了新手段。已有研究揭示了NaClO对肠炎沙门菌的蛋白质组学应答，但对其进入VBNC状态的条件与适应机制仍缺乏系统认识。本研究旨在探讨NaClO诱导肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis）形成VBNC状态的条件、特征及其应激响应机制，并通过转录组与蛋白质组联合分析进行阐释。

　　如图1A所示，当肠炎沙门菌暴露在50 mg/L次氯酸钠溶液中时，可培养细胞数量迅速下降，而仍存活的细胞数量维持在106～108 cells/mL之间。经过2.5 h处理后，虽然菌落已无法培养，但仍有约61%的细胞保持活性（图1F），说明大量细胞进入了可存活但不可培养（VBNC）状态。该浓度与常规食品加工和屠宰环节的消毒水平相当，意味着在常规消毒条件下，部分沙门菌仍可能以VBNC形式存活，并在适宜条件下复苏。

　　图1 肠炎沙门菌在50 mg/L次氯酸钠作用下0.5～3 h的可培养与可存活细胞变化

　　扫描电镜和透射电镜结果显示，正常菌体呈规则杆状、膜结构完整；而VBNC状态的菌体体积明显变小，细胞膜出现破裂或不规则形态，甚至部分细胞发生溶解（图2A–H），表明强氧化环境导致细胞结构受损。

　　VBNC菌的活性氧（ROS）含量显著升高（图2I），说明氯消毒产生的自由基会在细胞内引发强烈的氧化应激，可能损伤DNA、膜结构和其他生物分子。

　　如图2J所示，VBNC菌的NAD⁺/NADH比值大幅上升，提示细胞内氧化还原平衡被破坏，能量代谢受抑，处于一种“低代谢休眠”状态。

　　VBNC细胞的ATP水平由对照组的3.9 nmol/L降至约0.98 nmol/L（图2K），说明氯处理破坏了能量代谢过程和膜完整性，导致能量耗竭，细胞处于休眠或濒死状态。

　　为了深入了解VBNC状态肠炎沙门菌对氯胁迫的分子适应机制，研究者利用全转录组测序分析了其mRNA水平变化。结果显示，VBNC组与对照组的表达模式差异明显（图3A），共有4134个转录本发生差异，其中267个基因上调，207个下调。GO富集分析显示，这些差异基因主要涉及刺激应答、信号传导及物质转运等功能（图3B）。

　　与对照组相比，VBNC细胞中两组分系统、生物膜形成、ABC转运蛋白、分泌系统及鞭毛装配等相关基因显著富集（图3C），说明细胞通过激活这些通路提高环境适应性。同时，与蛋白合成和结构功能相关的基因被下调，反映出细胞降低代谢活性，以维持低能耗的存活状态。

　　为了进一步揭示VBNC状态下的应激机制，研究者对其蛋白质组进行了分析。结果发现，共检测到21594条肽段和4464种蛋白，其中1031种显著差异表达（上调613种，下调418种）（图4A）。

　　功能富集结果显示，这些差异蛋白主要参与应激响应、生物调控、细胞通讯以及能量代谢等过程（图4B）。KEGG通路分析进一步表明，柠檬酸循环、HIF-1信号通路及糖酵解/糖异生等能量代谢相关途径被显著激活（图4C）。这些变化说明VBNC细胞在受到氯胁迫后，通过调节代谢与信号通路来维持基础生命活动。

　　基因与蛋白表达的关联分析显示，两者的表达变化并非完全对应（图5A），这与转录后及翻译后调控有关。尽管如此，二者在多个关键通路中呈现共同富集，包括代谢途径、ABC转运系统、DNA复制及生物膜形成（图5B），表明这些通路是细菌维持VBNC状态的核心环节。

　　VBNC状态下，多种外排泵相关基因显著上调，其中dppC、lolD、ugpE等ABC外排泵基因提高16～32倍（图6A）。蛋白质组结果显示，多药外排泵蛋白AcrA、TolC、MdtK等也明显上调，尤其是RND型外排系统AcrAB-TolC及其调控因子ramA上升2倍以上。这些变化表明，VBNC细胞通过增强外排能力，主动排出有毒物质与消毒剂成分，从而保持细胞内部稳定并延长存活时间。

　　VBNC细胞中，氧化应激调控相关基因显著激活。红氧敏感转录因子SoxR和还原蛋白RseC分别上调4倍与8倍（图6B），显示OxyR依赖的氧化防御系统高度活跃。同时，抗氧化蛋白如硫氧还蛋白（TrxA/B）和谷胱甘肽还原蛋白（GrxB/C）显著上调。

　　此外，与电子传递及氧化还原调控相关的tucA、fadA、apbE、mioC、lldD及NAD威廉希尔H-脱氢酶复合体等基因均显著增强表达，说明细胞通过提高氧化还原活性与抗氧化能力来抵御ROS的破坏。这种应答帮助VBNC细胞在强氧化环境中维持能量代谢平衡和基本生理功能。

　　VBNC状态下，肠炎沙门菌的DNA修复系统被显著激活。SOS反应相关调控因子LexA和RecX的表达分别上升约2倍和4倍，表明SOS修复通路被启动（图6C）。LexA调控基因的普遍上调说明细胞正积极应对DNA损伤，相关的修复基因如radA、radC、recO和recN上调幅度达2–16倍。与此同时，核苷酸切除修复基因（uvrA、uvrB、uvrC、uvrD）、DNA错配修复基因（mutH、mutL、mutS、vsr）及核糖体蛋白基因（rplD、rplM、rplP、rpsP）也显著上调。

　　此外，与DNA损伤应答相关的GTP酶（mnmE、typA、RsgA）及DNA依赖ATP酶（RecB、YeaH等）表达升高，进一步说明修复机制处于活跃状态。蛋白质组结果也验证了DNA修复相关蛋白（如MutH、MutL、RadA、RadC）的显著富集。总体上，这表明氯消毒造成的DNA损伤超过了细胞常规修复能力，促使细菌启动SOS及突变型修复机制来维持生存。DNA复制相关蛋白如DnaA与RecF也上调，有助于细胞在受损环境中维持基因复制稳定。

　　研究发现，VBNC状态下的肠炎沙门菌仍保持甚至增强了部分致病相关功能。III型分泌系统（T3SS）及其效应蛋白显著上调，其中sopA、sopB、sspH2、sipA上调2～8倍，结构蛋白SseA与SseL上调约2倍（图6D）。T3SS作为细菌入侵宿主的重要装置，可将毒力蛋白直接注入宿主细胞，增强感染能力。

　　同时，VBNC细胞的鞭毛基因如fliA、fliF、flgA等显著上调4～32倍，σ28因子（fliA）表达上升约9倍，说明鞭毛生成与运动性增强。这有助于细菌在不利环境下移动、形成生物膜并寻找更适宜的生存区域。黏附相关基因shdA、fimH、sadA、misL也上调4～16倍，蛋白层面上黏附蛋白PagN与FimH上调约2倍，提示其黏附与侵袭能力增强。

　　更值得关注的是，代谢微结构Eut和Pdu系统显著上调8～32倍，涉及乙醇胺（Eut）与1,2-丙二醇（Pdu）的利用通路。这些细胞代谢囊泡可包裹有害中间产物，提升代谢效率，使细菌能在肠道缺氧环境中更具生存优势。相关调控基因arcA、arcB及cAMP-Crp调控因子也同步上升2～8倍，进一步增强能量代谢与适应能力。

　　这些变化表明，VBNC状态下的沙门菌可能仍具活跃的代谢与致病潜能，在人体肠道内可能造成更强的感染风险，对食品安全和公共卫生构成潜在威胁。

　　为验证转录组与蛋白质组结果的可靠性，研究者随机选取了8个差异基因和8个差异蛋白进行RT-qPCR和PRM验证。结果显示，acrA、arcD、ampG、fadA、pduL、radC、soxR等基因的表达趋势与RNA-seq结果一致（图5C），蛋白质组的PRM验证结果也与原始数据相符（图5D），说明本研究的多组学分析数据具有较高可靠性。

　　本研究结合转录组与蛋白质组分析，系统揭示了氯消毒诱导的VBNC状态肠炎沙门菌的适应机制。结果表明，这些细胞通过多威廉希尔种应激途径应对氧化损伤与环境压力，包括DNA修复、SOS反应、氧化应激防御、多药外排系统（RND）以及III型分泌系统（T3SS）。同时，鞭毛和代谢囊泡（Eut与Pdu BMCs）的增强表达可能进一步提升其致病性与肠道生存能力。

　　研究提示，氯消毒可能无法彻底清除沙门菌VBNC细胞，这类细胞仍具潜在感染风险，亟需制定更科学、彻底的消毒策略，以降低其对食品与公共健康的威胁。

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